摘要:在質(zhì)量指南Q8和最近的皮膚外用制劑的質(zhì)量和等效性指南草案中，對產(chǎn)品和工藝理解的要求越來(lái)越高，揭示了流變學(xué)方法作為外用半固體劑型微結構表征工具的巨大潛力。因此，程序標準化是迫切需要。這項工作旨在開(kāi)發(fā)和驗證流變學(xué)分析的方法指南。用1%氫化可的松乳膏作為模型乳膏制劑。通過(guò)風(fēng)險評估分析，對所選關(guān)鍵方法變量(幾何形狀、溫度和應用模式)的影響進(jìn)行了廣泛的流變關(guān)鍵屬性評估，包括零剪切黏度、上剪切稀化黏度、下剪切稀化黏度、無(wú)限剪切黏度、旋轉屈服點(diǎn)、觸變相對面積、線(xiàn)性黏彈性區域、振蕩屈服點(diǎn)、儲能模量、損耗模量和損耗角正切。該方法的擬議驗證包括流變儀鑒定，隨后是關(guān)于流變特征采集的眾多操作關(guān)鍵參數的驗證。觸變相對面積、振蕩屈服點(diǎn)、流動(dòng)點(diǎn)和黏度相關(guān)的終點(diǎn)被證明是高度敏感和有區別的參數。這一基本原則為開(kāi)發(fā)可靠和穩健的流變特征采集提供了標準框架。

關(guān)鍵詞:流變學(xué)；方法驗證；設備驗證；外用制劑；監管要求

1.     引言

   外用半固體劑型包括復雜的多相系統，需要詳細的流變學(xué)表征，因為這些特性可能會(huì )顯著(zhù)影響質(zhì)量和性能[1，2]。流變學(xué)是研究材料的流動(dòng)和變形行為，可以通過(guò)對樣品施加外力(剪切誘發(fā)變形)來(lái)測量[3]。與配方黏度、彈性和塑性相關(guān)，流變行為可能會(huì )影響產(chǎn)品制造、外觀(guān)、包裝、長(cháng)期穩定性、分散、感官特性和體內性能[4，5]。因此，流變評估被證明是一種有用的質(zhì)量和穩定性指標，揭示了有關(guān)批次穩定性、產(chǎn)品美學(xué)特性、治療效果和患者依從性的預測信息[2，6，7]。加強對流變參數的理解和控制是新藥或仿制藥申請的可持續發(fā)展的基礎，滿(mǎn)足利益相關(guān)者的期望[8]。

外用半固體劑型主要表現出非牛頓行為，因為較高的剪切速率會(huì )導致黏度降低，這使得在皮膚上使用變得更容易[9]。因此，配方開(kāi)始流動(dòng)需要一定的臨界應力值(屈服應力)。小于這個(gè)數值，產(chǎn)品主要呈現彈性；相反，大于該數值，材料主要顯示塑性流動(dòng)[10]。

類(lèi)似地，有許多流變學(xué)屬性直接影響外用產(chǎn)品的微觀(guān)結構，從而影響藥物的很多個(gè)方面。例如，制劑在皮膚上的鋪展性和生物黏附性受黏彈性的影響很大。當患者直接在皮膚上涂抹外用制劑，這些感官屬性對于確?；颊叩目山邮苄砸约爸委熞缽男灾陵P(guān)重要[10–13]。

穩定性和物理外觀(guān)也取決于流變特性。詳盡的流變特性為產(chǎn)品在貨架期內沉淀或分離的原因提供了有價(jià)值的分析。此外，該方法可以確定無(wú)論任何時(shí)候，采取包裝軟管給藥還是計量泵[10]給藥，是否會(huì )對產(chǎn)品的微觀(guān)結構有顯著(zhù)影響。還可以反映生物制藥特性，例如藥物釋放和滲透也依賴(lài)于配方的流變特性[13，14]。鑒于上述所有原因，流變行為是半固體制劑目標藥物質(zhì)量概況的關(guān)鍵質(zhì)量屬性[5，10，15]。

流變特性高度依賴(lài)于關(guān)鍵藥物原料(CMAs)和關(guān)鍵工藝參數(CPPs)，因此，密切的流變監控可以成為指導和縮短產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、確保產(chǎn)品質(zhì)量和減少制造過(guò)程中批次差異的有用工具[7]。這符合制藥行業(yè)日益增長(cháng)的對工藝的理解和提高產(chǎn)品質(zhì)量的需求。這也是質(zhì)量源于設計(QbD)的基本原則。這種新的制藥監管概念是以一種系統的、基于風(fēng)險的方法為基礎提出的，通過(guò)對原材料和工藝參數的詳細了解來(lái)調整所需的產(chǎn)品質(zhì)量狀況[11，16，17]。

QbD方法首先涉及目標藥物質(zhì)量概況(QTPP)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQAs)的定義，其中流變特性應是首要關(guān)注的問(wèn)題。之后，通過(guò)詳細的風(fēng)險分析，應該清楚的識別關(guān)鍵材料屬性和關(guān)鍵工藝參數。建立好這些參數后，應進(jìn)行實(shí)驗設計(Does ),以便最終建立設計區間和可行的控制策略[11，16，17]。最后一步是最重要的，因為這一步確保這一過(guò)程是可控的，而且保持在確定的設計區間內[18]。利用了過(guò)程分析技術(shù)(PAT)的制造過(guò)程中的測量可以整合為控制策略的一部分。盡管過(guò)程分析技術(shù)越來(lái)越多地應用于固體劑型，但其在半固體制劑中的應用還不是一種常見(jiàn)的解決方案[19]。一些作者已經(jīng)探索了流變學(xué)作為過(guò)程分析技術(shù)工具的潛力。

Qwist等人開(kāi)發(fā)了一種壓差裝置，可從大量中間產(chǎn)品/產(chǎn)品流中取樣，并通過(guò)頻率掃描確定儲能模量(G′)和損耗模量(G″)，以及測試流動(dòng)曲線(xiàn)[ 19]。此外，Van Heugten及其同事評估了灌裝溫度對軟膏屈服應力的影響?；谶@一知識，作者能夠建立一個(gè)最佳的灌裝黏度范圍，這反過(guò)來(lái)又能夠保證罐裝時(shí)最小的重量變化，以及最終產(chǎn)品期望的屈服應力[20]。

一旦控制策略的可變性被深刻理解，如果遵循QbD原則，一個(gè)更加靈活的監管批準就可以得以實(shí)現。作為控制策略的一部分，通過(guò)降低產(chǎn)品批間差和提高產(chǎn)品穩定性，流變學(xué)作為過(guò)程分析技術(shù)工具，有助于提升藥物配方和制造能力[11，16]。

正如外用制劑質(zhì)量和一致性評價(jià)的草案指南中強調的那樣，在開(kāi)發(fā)一款藥物產(chǎn)品的時(shí)候，以病患為中心的要求應當加以重視。因此，正如前面提到的，以下幾個(gè)方面，例如高度依賴(lài)于流變學(xué)特性的患者可接受度，在開(kāi)發(fā)藥物的時(shí)候需要首先考慮。這對新藥產(chǎn)品是有效的，同時(shí)對處理仿制藥物也具有重要意義的。

作為臨床終點(diǎn)研究的替代方案的EMA指南草案，是一個(gè)外用仿制藥等效性評價(jià)的標準框架。因此，為了藥物的申請，拓展了的藥物等效性標準必須得以滿(mǎn)足。（i） 定性、定量和微觀(guān)結構與參照樣品的一致性（分別為Q1、Q2、Q3）；（ii）產(chǎn)品體外釋放的性能測試（Q4），以及最終的，（iii）如果測試樣品被認定是復雜的制劑，等效性驗證應當通過(guò)體外皮膚透過(guò)或者皮膚動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)行驗證。

在這種情況下，微觀(guān)結構等效性驗證是外用仿制藥生物等效性評估的最重要部分。

經(jīng)文獻廣泛描述的多種因素，影響藥物產(chǎn)品的微觀(guān)結構，這其中流變學(xué)特性具有無(wú)可辯駁的作用。因此，EMA提出了描述給定藥物制劑流變學(xué)行為的流變學(xué)參數。這些參數包括：（i） 完整的剪切流動(dòng)曲線(xiàn)：應力（或粘度）與剪切速率的關(guān)系；（ii）屈服點(diǎn)值；（iii）線(xiàn)性粘彈性響應，（iv）儲存模量和損耗模量與頻率/應力的關(guān)系；和（v）觸變相對面積。盡管FDA需要提供流變終點(diǎn)，與EMA相比，該列表并不詳盡。

然而，盡管存在一些關(guān)于流變學(xué)適用性和整體重要性的文獻報告，但對這一技術(shù)的正式驗證程序缺乏理解和標準化。迄今為止，文獻中既沒(méi)有定義半固體制劑流變特性的參數，也沒(méi)有定義它們的接受極限。此外，在放行新批次時(shí)，重要的流變參數不包括在常規分析中[6]。在這種情況下，應提供適用于所有半固體劑型的廣泛驗證，確保開(kāi)發(fā)的流變學(xué)測量方法具有適當的鑒別能力，以確定制劑的“一致性”，并檢測可能影響臨床表現的制劑差異[26]。此外，還應提供詳盡的具有強制性質(zhì)量參數的流變學(xué)特征。

為了實(shí)現流變方法的標準化，無(wú)論是用于輔助質(zhì)量控制還是潛在的過(guò)程分析技術(shù)工具，我們對可能影響流變特性的流變操作參數進(jìn)行了全面表征。為此，分析質(zhì)量源于設計(aQbD)的假設，包括用于對關(guān)鍵方法變量(CMV)對關(guān)鍵分析屬性(CAA)的影響進(jìn)行排序的風(fēng)險評估，被認為是對流變儀的操作范圍、實(shí)驗設置和流變測量方法進(jìn)行系統驗證，以獲得合適的流變學(xué)特征。

考慮到常規分析驗證的所有相關(guān)因素，包括測試精度、區分·能力和可靠性，進(jìn)行了特定的旋轉和振蕩測量以及數據分析[27]。1%（w/w）氫化可的松乳膏被用作模型產(chǎn)品。指南草案中指出的關(guān)于外用產(chǎn)品的質(zhì)量和等效性的其他建議也同樣得到了處理[21]。

2.         材料和方法

2.1.材料

微粉化氫化可的松乳膏由Laboratórios Basi Indústria Farmacêutica S.A.友情提供。（Mortágua，葡萄牙）。對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯分別是購自阿爾法埃莎（德國坎德?tīng)枺?/span>Kolliwax GMS II（甘油單硬脂酸酯），KolliwaxCA（鯨蠟醇）、Kollicream IPM（肉豆蔻酸異丙酯）和 Dexpanthenol Ph. Eur. 由巴斯夫歐洲公司（德國路德維希港）友情提供。硬脂酸由Acorfarmadistribuicion S.A提供.（西班牙馬德里）。三乙醇胺購自 Panreac AppliChem（德國達姆施塔特）。液體石蠟由LabChem Inc.（美國賓夕法尼亞州Zelienople）提供。甘油購自VWR Chemicals（比利時(shí)魯汶）。水被凈化（Millipore）并在使用前通過(guò)0.22毫米的尼龍過(guò)濾器過(guò)濾。黏度參考標準液RT5000（Fungilab，Spain）用于流變儀鑒定研究。

1. 2.2 方法

2. 2.2.1 氫化可的松乳膏的制備

氫化可的松乳膏 o/w乳膏制劑通常借助于Ultra-Turrax X 10/25 (Ystral GmbH，Dottingen，德國)設備制備。連續相和分散相分別制備，并加熱至70°C[11，28]。之后，活性藥物成分溶解在分散相中。先前的研究建立了與制造過(guò)程的速率、持續時(shí)間和溫度相關(guān)的最佳實(shí)驗設置。生產(chǎn)后，將乳膏制劑冷卻至室溫。每批次制備0.5千克。所有樣品都儲存在20–25°c下

為了證明流變儀器的鑒別能力，考慮到單硬脂酸甘油酯的不同濃度，制備了三種配方: 5% (F5)，10% (F10)和20% (F20)。由于其增稠特性，這種賦形劑對產(chǎn)品微觀(guān)結構具有重大影響[11，28]。請注意，F10被視為參考配方。此外，用10%的單硬脂酸甘油酯制備第四種制劑，但是考慮到制造過(guò)程中不同的均化速率。該配方將作為F10陰性對照(F10NC)進(jìn)一步處理。

1. 2.2.2流變特性

使用HAAKE MARS 60 (賽默飛，Karlsruhe，德國)研究了所有產(chǎn)品的流變特性，該儀器配備有作為溫度控制單元的半導體系統。使用Haake RheoWin數據管理軟件(德國卡爾斯魯厄，Thermo Scientific)評估數據。對于每次分析，樣品罩用于最大限度的減少溫度波動(dòng)。

考慮到EMA最近發(fā)布的關(guān)于局部產(chǎn)品質(zhì)量和等效性的指南草案，完整的流變特性應包括旋轉和振蕩測量[21]。

旋轉測試是樣品破壞性的。從這些測量中檢索的信息使得能夠評估影響結構破壞和/或重新排列的小的周期性變形。此外，通過(guò)這些測試，還可以研究材料的恢復能力。

關(guān)于振幅和頻率掃描測試的振蕩測試。一般來(lái)說(shuō)，由于所施加的剪切應力減小，這些測量可以被認為是非破壞性的，然而，應該指出的是，在振幅掃描測試過(guò)程中，仍然會(huì )出現較小的系統擾動(dòng)。振蕩測量旨在評估材料的黏彈性，同時(shí)伴隨著(zhù)小振幅變形力[28]。以下各節詳細介紹了這兩種方法的主要成果。

旋轉測量

使用C35/2 /Ti錐形轉子在32℃下進(jìn)行旋轉試驗。使用正位移注射器將大約0.3克制劑置于TMP35的下板上。設置0.1毫米的預設間隙。

從0.01到250 Pa的線(xiàn)性CS階躍測試，時(shí)間800 s，以描繪流動(dòng)曲線(xiàn)[? = f(τ)]。為了表征流動(dòng)行為，檢測接下來(lái)的響應或關(guān)鍵分析屬性(CAA):零剪切黏度(?0)、高剪切稀化黏度(?U)、低剪切稀化黏度(?L)、無(wú)限剪切黏度(?∞)和屈服點(diǎn)(τ0)。

為了評估觸變性能，在300 s-1[τ=f(??]期間，以0.01至300s-1的剪切速率進(jìn)行CR連續掃描試驗，然后再降至0.01。從該分析中，計算觸變相對面積(SR)。

振蕩測量

使用P35/Ti平板轉子在32℃下研究黏彈性。使用注射器將約1g制劑施加到TMP35的下板。首先在1Hz的頻率下進(jìn)行從0.01到600Pa的振幅掃描測試，以評估線(xiàn)性黏彈性區(LVR)平臺，屈服點(diǎn)(τ0，振蕩模式)和流動(dòng)點(diǎn)(τf)。之后，在LVR平臺內進(jìn)行了頻率掃描分析。在1Hz下計算儲能模量(G′)、損耗模量(G″)和損耗角正切(tan δ)。

2.2.3流變方法驗證

目前的工作旨在建立一種實(shí)用且簡(jiǎn)單的方法來(lái)驗證流變分析。在這種情況下，按照傳統的驗證程序，確定了精確度和可靠性，以及靈敏度、特異性、選擇性(辨別能力)[21，29]。請注意，線(xiàn)性不被視為流變方法驗證的相關(guān)參數，因為在流變曲線(xiàn)的采集中不存在固有的線(xiàn)性。

風(fēng)險評估

根據以前的知識，可以廣泛地評估可能對流變終點(diǎn)產(chǎn)生直接影響的分析條件。為了確定這些參數中哪些需要進(jìn)一步研究和控制，構建了一個(gè)魚(yú)骨圖，見(jiàn)圖1。此外，還進(jìn)行了風(fēng)險評估矩陣(REM)來(lái)對之前確定的分析條件進(jìn)行排序，見(jiàn)表1 [17，30]。

圖1.應用于流特征采集和驗證的假想魚(yú)骨圖

表1.流變學(xué)方法驗證的初始風(fēng)險評估矩陣(REM)

關(guān)鍵: 低風(fēng)險變量(L)；中等風(fēng)險變量(M)；高風(fēng)險變量(H)。

設備鑒定

通過(guò)確定參考標準品的黏度特征來(lái)進(jìn)行流變儀鑒定?？紤]了兩個(gè)溫度，25°C和32°C。第一個(gè)溫度符合標準的規定，而第二個(gè)溫度目的是為了重現之前報告中的方法條件。

為了評估方法精度，在三個(gè)不同的日期進(jìn)行了三次測量。

精確度

為了測試精度，每項測試在三個(gè)不同的日期進(jìn)行了十二次流變測量，以符合歐洲藥品監督局的最新要求。在驗證先前定義的終點(diǎn)時(shí)，可以接受小于15%的相對標準偏差。 [6，31]。

區分能力

驗證程序中最重要的步驟之一是評估方法的鑒別能力，即方法鑒別不同配方的能力。為了解決這一問(wèn)題，應證明方法的靈敏度、特異性和選擇性[21，31，32]。

對F5、F10和F20的流變特性進(jìn)行了交叉對比。此外，F10NC流變剖面被確定為一個(gè)額外的判別因素。通過(guò)跟蹤這類(lèi)制劑的流變特性，可以驗證該方法的鑒別能力，因為微結構差異對輔料的濃度和生產(chǎn)工藝的變化高度敏感[5,21,23,33–35].在這種情況下，通過(guò)評估關(guān)鍵分析屬性對單硬脂酸甘油酯濃度變化的響應來(lái)驗證流變方法的靈敏度。如果F5測得的關(guān)鍵分析屬性低于F10，并且F20關(guān)鍵分析屬性平均值優(yōu)于F10，則認為流變方法是敏感的。

另一方面，通過(guò)評估F5、F10和F20的關(guān)鍵分析屬性是否能夠成功地反映不同的單硬脂酸甘油酯含量來(lái)評估該方法的特異性。使用因變量為增稠劑濃度的關(guān)鍵分析屬性的線(xiàn)性回歸模型來(lái)估計相關(guān)系數(R2)。如果R2大于0.9，則該方法被認為是特異的[31，33，36]。方法選擇性以統計方式記錄。在參考配方(F10)和特別制造的配方F5、F20和F20CN之間進(jìn)行成對比較。對于p < 0.05的值，平均值之間的差異被認為是顯著(zhù)的。如果每種制劑的關(guān)鍵分析屬性存在顯著(zhù)差異，則認為該方法具有選擇性。在鑒別能力研究中，每種配方有六個(gè)重復，每次流變測量都要考慮。

穩定性

為了評估方法的穩定性，評估了三種不同實(shí)驗設置的影響。這些因素包括溫度波動(dòng)(+2°C和–2°C)、樣品應用(容積式注射器與抹刀)以及最終轉子的影響。對于旋轉研究，C35/2 /Ti錐TMP35板(C35-P35)配置的性能與P35/Ti板-TMP35板(P35-P35)配置進(jìn)行了比較。對于振蕩測量，比較了P35/Ti板TMP35板(P35-P35)配置與P20/Ti板TMP20板(P20-P20)配置的影響。如果在標準方法參數設置下，關(guān)鍵分析屬性偏離平均關(guān)鍵分析屬性不超過(guò)15%,則該方法被認為是穩定的。

2.2.4統計分析

使用GraphPad Prism 5軟件(美國加利福尼亞州圣地亞哥)通過(guò)使用帶有Tukey多重比較法的單因素方差分析進(jìn)行統計分析。當p < 0.05時(shí)，平均值之間的差異被認為具有統計學(xué)意義。